|
|
Analýza vazby proteinu IFI16 na DNA
Kratochvilová, Libuše ; Smetana, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá vazbou interferonem gama indukovatelného proteinu 16 (IFI16) na DNA s potenciálem tvorby G-kvadruplexu. Protein IFI16 obsahuje dvě tandemově umístěné DNA-vazebné HIN domény vykazující rozdílnou vazbu ke strukturám DNA. Bylo prokázáno, že protein IFI16 preferenčně váže struktury G-kvadruplexů oproti jiným strukturám DNA. G-kvadruplexy jsou nekanonické sekundární lokální struktury DNA (nebo RNA), které se snadno formují za fyziologických podmínek v řadě významných regulačních oblastech genomu, nebo jsou součástí genomů řady virů a patogenů. Schopnost rozpoznání, specifické vazby a stabilizace struktur G-kvadruplexů odráží zapojení proteinu IFI16 do buněčných procesů replikace, transkripce a translace a iniciaci vrozených imunitních odpovědí. V první části diplomové práce byly vybranými biofyzikálními metodami charakterizovány sekvence syntetických oligonukleotidů s potenciálem tvorby G-kvadruplexu a izolován protein IFI16 plné délky, který byl následně použit pro in vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty s charakterizovanými oligonukleotidy. V poslední části práce byly kvasinkové isogenní kmeny lišící se sekvencemi responzivního elementu transformovány plazmidovými vektory pro expresi proteinů p53 a IFI16 s konstitutivními i GAL inducibilními promotory a optimalizován model jednohybridního kvasinkového systému pro studium interakcí proteinu IFI16 in vivo. Z výsledků vyplývá, že většina analyzovaných sekvencí je schopna in vitro tvořit struktury G-kvadruplexu, a to i za přítomnosti pouze jednoho opakování tří a více G-bází. Zatímco přítomnost několika opakování guaninových bází oddělených jednonukleotidovým spacerem vedla k tvorbě intermolekulárních struktur G-kvadruplexů, mutace v původní sekvenci G-kvadruplexu indukovala tvorbu intramolekulárních struktur s rozdílnými konformacemi. In vitro vazebné a kompetitivní vazebné experimenty prokázaly specifickou vazbu proteinu IFI16 ke strukturám G-kvadruplexů bez rozdílů preference vazby proteinu k určité konformaci G-kvadruplexu. Stabilizace struktur G-kvadruplexu in vivo za responzivním elementem transkripčního faktoru (p53) v promotoru reportérového genu indukovala represi transkripce daného genu. Při absenci jakéhokoliv vazebného místa proteinu IFI16 docházelo k protein-proteinové interakci mezi proteiny IFI16 a p53, která vedla ke zvýšení transaktivačního potenciálu proteinu p53, přičemž vazba proteinu p53 a iniciace transkripce reportérového genu byla ovlivněna nejen přítomností motivu G-kvadruplexu a jeho stabilizací, nýbrž i sekvencí DNA sousedící s responzivním elementem p53.
|
host ::
RSS.